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Avoid repeated freeze/thaw cycles.单抗专一性高，但是经过SDS-PAGE变性胶电泳的蛋白质可能由于原来的识别位点构象发生改变而不被识别，多抗不如单抗专一性高但更容易得到结果。如果还有多种抗体选择，那当然是来源于兔或者小鼠抗体为好，因为后继的检测试剂盒一般都是针对兔鼠的居多，因而选择范围更大通用性也更强。除了无标记的一抗，还有生物素等各种标记一抗。用荧光标记的一抗直接检测而降低背景和非特异结合，不过由于少了二抗的X联放大信号扩增，信号也会比较弱，所以需要选择荧光信号特别明亮的标记，一抗的稀释度通常需要预实验摸条件，可以根据说明书上建议的WB稀释度附近做2—3个梯度，如果是用化学发光法检测，由于灵敏度高而建议将稀释度再放大一些。二X试剂的作用是信号扩增，选择是根据一抗的标记形式而决定的，对于无标记的一抗，可以选择对应一抗来源种属的标记二抗，或者更便宜的标记蛋白A（来自金黄葡萄球菌Protein A可以高度亲和来自人，兔，豚鼠的IgG，但对大鼠、山羊和鸡的IgG亲和力弱）。不过，二抗是更可靠的选择——除了要选择对应一抗的来源种属，也要根据你准备采用的检测方法选择合适的标记。酶促反应比同位素安全且快速，已经成为Western Blot的主流检测方法。酶促反应可以搭配不同的底物从而实现不同的显色方法：化学发光Chemiluminescent和底物显色Colormetirc/Chromogen，前者灵敏度很高——随着各大厂家努力开发研制灵敏度更高的发光底物，化学发光法的灵敏度已经达到pgX别，甚至还有 FemtoX别的，灵敏度X过了同位素；而后者由于直接显色而操作简便且成本低。zui为大家熟悉当数辣根过氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase，属于过氧化物酶POD类）和碱性磷酸酶AP（Alkaline Phosphatase），此外还有比较少见的葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）、β半乳糖苷酶β-Galactosidase。HRP 辣根过氧化酶是zui常见的酶促发光或显色的交联酶，由于HRP比活高、特异性更强、分子量小（40kD）、稳定和作用底物范围广的X点而得到广泛使用。HRP的底物种类有不少，主要可以分为化学发光底物和生色底物2大类。对于底物的选择，主要考虑的是灵敏度、背景和使用的方便性和稳定性——比如底物可溶性高使用就比较方便；对于WB来说产物不可溶有助于信号在原位的积累和结果的稳定（产物可溶的底物更适合于Elisa）。zui熟悉的底物应该是33二氨基联苯胺DAB，DAB可以和HRP作用形成褐色不溶性产物，灵敏度高，特异性好，缺点就是需要现配现用，显色后光照数小时会褪色，不能*保存，需要拍照记录，而且有毒。DAB的选择有一点小小的技巧——33二氨基联苯胺4盐的纯品分子量为360.1，通常是深棕色粉末，不太好溶于水，容易得到有色颗粒的溶液而导致膜上的背景，而且价格还被炒得贵；但是如果选择2水合33二氨基联苯胺4盐（分子量396.14）就是白色粉末状晶体，易溶，溶液无色均匀，量大价格还便宜。DAB还有溶剂形式的，便于使用。由于DAB显色是褐色，不如4-CN反差大容易拍照，有的厂家还推出了DAB+4-CN混合底物，结合了DAB灵敏度高和4-CN背景低，易成像的X点，能获得很好的黑色沉淀成像。用金属离子增强信号的DBA显色试剂灵敏度可以高达20pg。TMB的signal-to-noise信噪比高，成分安全，特别合适于灵敏度要求高的WB，但是也要避免由于灵敏度高而引起的高背景，因此可以相应的延长封闭的时间和注意洗涤的次数；ACE各方面性质与DAB相似，但灵敏度要比DAB差一点。HRP的生色底物显色有DAB，4-CN ，CN/DAB，AEC和TMB等（而得到可溶性产物的底物如OPD，ABTS等则适用于ELISA）中，与化学发光法中的酶促基团发光不同，底物显色主要是利用底物在有HRP和的存在下失去电子而呈现出颜色变化积累这一过程检测WB的结果。Western Blot检测系统中常用交联酶两大家族中的另外一类就是AP——碱性磷酸酶。碱性磷酸酶很早就被用于检测系统——包括固定化抗原（WB）检测和核酸检测。但是做过AP实验的经常会遇到膜上显色背景偏高的问题，所以就WesternBlot本身来说偏爱HRP的要比AP多——分子克隆III解释说由于在我们常用的封闭剂：脱脂奶粉和牛血清白蛋白BSA中富含AP，这样当然显色背景会高。所以分子克隆III推荐的AP适用封闭剂是6%的酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmo lEDTA 65度加热一小时确保AP失活后再用于封闭。一些研究的样本自身也含有较高水平的碱性磷酸酶，虽然实验上很容易实现抑制内源AP影响，但实际上容易被忽略。AP显色底物生成的产物主要是蓝紫色，成像性好容易拍照。anti-cat IFN-gamma mAb MT114，biotinylated瓜氨酸化蛋白抗体：偶联ATTO 680瓜氨酸化蛋白抗体：偶联ATTO 700瓜氨酸化蛋白抗体：碱性磷酸酶瓜氨酸化蛋白抗体：偶联APC瓜氨酸化蛋白抗体：偶联生物素瓜氨酸化蛋白抗体：偶联FITC瓜氨酸化蛋白抗体：偶联HRP瓜氨酸化蛋白抗体：偶联PE/ATTO 594瓜氨酸化蛋白抗体：偶联PerCP瓜氨酸化蛋白抗体：偶联RPE瓜氨酸化蛋白抗体：偶联链霉亲和素瓜氨酸化蛋白抗体瓜氨酸化蛋白抗体瓜氨酸化蛋白抗体：偶联ATTO 390瓜氨酸化蛋白抗体：偶联ATTO 488瓜氨酸化蛋白抗体：偶联ATTO 565瓜氨酸化蛋白抗体：偶联ATTO 594瓜氨酸化蛋白抗体：偶联ATTO 633瓜氨酸化蛋白抗体：偶联ATTO 655瓜氨酸化蛋白抗体：偶联ATTO 680瓜氨酸化蛋白抗体：偶联ATTO 700瓜氨酸化蛋白抗体：碱性磷酸酶瓜氨酸化蛋白抗体：偶联APC瓜氨酸化蛋白抗体：偶联生物素瓜氨酸化蛋白抗体：偶联FITC瓜氨酸化蛋白抗体：偶联HRP瓜氨酸化蛋白抗体：偶联PE/ATTO 594瓜氨酸化蛋白抗体：偶联PerCP瓜氨酸化蛋白抗体：偶联RPE瓜氨酸化蛋白抗体：偶联链霉亲和素瓜氨酸化蛋白抗体O-联 N-葡糖胺抗体O-联 N-葡糖胺抗体：偶联ATTO 390O-联 N-葡糖胺抗体：偶联ATTO 488O-联 N-葡糖胺抗体：偶联ATTO 565O-联 N-葡糖胺抗体：偶联ATTO 594瓜氨酸化蛋白抗体瓜氨酸化蛋白抗体瓜氨酸化蛋白抗体：偶联ATTO 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